试剂解冻与混合步骤

1. 从冰箱中取出试剂。
2. 缓慢解冻试剂，以保持其活性。
3. 轻轻颠倒试剂进行混合，尽量避免产生气泡。
4. 在低速下进行离心。

注意：在混合过程中，要尽量避免气泡的产生，因为气泡可能会影响酶的活性或实验结果的准确性。

稀释步骤

1) 若需追踪模板，请按以下步骤进行稀释；
2) 若无需追踪模板，则可直接用无菌超纯水稀释cDNA，或直接使用cDNA原液。

荧光定量仪器设置

常见的荧光定量仪器通常为96孔反应盒，基本结构为12列×8行。

实例解析

以基因1为例，配制大体系的建议：

• HieffUNICON®ColorGPSqPCRMasterMix 10μL
• 根据孔数，选择n+1或n+2作为总数（每孔18μL）进行配制。
• 正向引物（10μM） 0.4μL
• 反向引物（10μM） 0.4μL
• 无RNA酶H2O 7.2μL

以上各组分配置完毕后，应紧闭管盖，并轻弹管壁以确保充分混匀，随后进行短暂的离心（1-2秒），再轻弹管壁以防止气泡产生，然后进行瞬间离心，确保所有溶液都沉到管底。

注意事项

若使用显踪剂，建议模板投入体积控制在2-5μL，以保证显踪效果；对于cDNA母液，建议控制在2μL（反应体系的1/10）以内，以避免影响扩增效果。

上样体系的配置

基因1检测组分单孔量配置

1. 配置大体系Mix，总量为18μL
2. 加入cDNA模板 2μL

完成加样后，确保管盖紧闭，轻弹管壁混匀后，放入小型离心机进行短暂离心1-2秒，轻弹管壁后再次瞬间离心，确保无气泡后置于洁净的96孔PCR管架上。

管子检查与程序设置

在上机前，仔细检查管子，保证管盖及管身无任何标记，管内无气泡、管壁无液体残留。若采用常规程序，请进行如下设置：

• 循环步骤
• 温度
• 时间
• 循环次数

预变性 95℃ 2分钟 1次; 变性 95℃ 10秒 40次; 退火/延伸 60℃（根据引物TM值和目的基因的长度）30秒；熔解曲线阶段依据仪器默认设置。

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