IPS诱导肠类器官的培养过程可以分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养，内胚层的分化，以及中后肠的模式化诱导和类器官的培养。本文将详细讨论第三阶段——类器官的培养，预计培养时间为14-28天。

一、准备工作

在进行类器官培养之前，需要准备好以下试剂和耗材：

• 人正常肠类器官培养试剂盒（abs9545）
• 基质胶（低因子、无酚红）（abs9495）
• 15ml离心管（abs7102）
• 15ml EP管若干（abs7119）
• 24孔细胞培养板（abs7035）
• 金属冰盒

具体组分及规格如下：

• 类器官培养基A：100ml
• 类器官原代培养缓冲液B：250ml
• 类器官传代消化液D：30ml
• 组织保存液E：100ml
• 类器官冻存液F：20ml
• 类器官传代培养缓冲液G：250ml

二、操作流程

1. 加胶-点板-加液

整个原代操作的关键步骤：

1. 准备工作：将基质胶在金属冰盒中于4℃冰箱过夜融化；枪头和离心管需在-20℃下预冷至少半小时；融化的基质胶应在4℃下储存，强烈建议在两周内用完。
2. 接种要求：使用24孔板，每孔填充25μl基质胶和500-750μl类器官培养基。
3. 接种密度：建议按1:25的比例接种（例如，300μl基质胶足以满足需求）。
4. 操作步骤：将基质胶加入细胞团，轻轻混匀后进行点板。此操作需在金属冰盒或冰上进行，熟练后应控制在半分钟以内。
5. 加液：将培养板放入37℃培养箱中，等待40-60分钟至凝胶形成，然后添加500-750μl类器官培养基A进行培养。约10-14天后，类器官直径应达到200-500μm，可进行传代操作。

2. 传代

根据类器官的数量和体积，传代可分为两种情况：

（1）类器官较多或体积较大：传代步骤

1. 收集和洗涤类器官：轻柔吸去培养基，添加缓冲液G，轻散基质胶并收集在15ml离心管中。
2. 洗涤：加足量缓冲液G，冷却后离心分层，保留类器官沉淀。
3. 类器官消化：添加类器官传代消化液，在超净台内消化，避免消化为单细胞。
4. 加胶、点板及加液：如原代步骤，完成后再培养。

（2）类器官数量不足或体积较小：操作步骤

1. 同样收集、洗涤，需关注细胞团的形成情况。
2. 根据细胞群体的大小，决定最终的接种密度。
3. 重点是保持基质胶的流动性，迅速点板及加液。

三、冻存

为了获得良好的复苏率，类器官在指数增长期进行冷冻。请注意：

• 收集类器官后，使用缓冲液G进行洗涤，确保基质胶被充分稀释。
• 冷冻前需添加冻存液F，并确保操作迅速，以避免对类器官的损伤。
• 梯度冻存可采用-80℃过夜后转移至液氮罐的方式。

四、复苏

在复苏过程中，需遵循以下步骤：

1. 准备37℃的水浴锅，确保环境无菌。
2. 快速解冻冻存管，并将类器官溶液转移至离心管，添加缓冲液G。
3. 完成后，依旧遵循加胶、点板及加液的流程。

关键注意事项

在整个操作过程中，保持基质胶冷藏，控制细胞密度，确保使用新鲜的生长因子，并严格执行无菌操作。通过细致的操作流程，我们能够成功培养功能性的人类肠道类器官，适用于疾病建模和药物筛选研究。

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