**RFL-6大鼠成纤维细胞培养指南**

一、细胞培养条件

细胞名称：RFL-6大鼠成纤维细胞

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：DMEM + 10% FBS + 1% 双抗

传代方法：首轮建议1:2传代，传代后每2天更换培养基。

备注：用无菌离心管收集培养基以留作对比培养。若对比效果不佳，建议直接使用尊龙凯时的完全培养基。

二、细胞处理及运输

收到细胞后，应让其适应良好状态后再灌满完全培养液，并密封好瓶口以确保细胞存活。处理细胞时，先用75%酒精对细胞瓶进行消毒，再在超净台上操作。之后，将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态。通过显微镜观察细胞生长情况，建议拍摄不同倍数的细胞照片（40x, 100x, 200x各一张），前三天的照片是售后服务的关键依据，未提供照片将默认收到细胞状态良好。

三、细胞培养步骤

a、细胞传代

在细胞汇合度未超过80%的情况下，收集培养液并留存5ml进行后续培养；当细胞密度超80%时，可以按以下步骤进行传代：

1. 弃去培养上清，并用不含钙、镁的PBS对细胞进行1-2次润洗。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，放入37℃培养箱中消化1-2分钟；观察细胞状态，若细胞已大部分变圆脱落，轻轻敲击培养瓶后加入5ml完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落，然后吸出，将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，并补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养。

b、细胞冻存

1. 当细胞生长达到80%时，弃去培养液，用PBS清洗一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞变化，待其回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化。轻轻吹打使细胞脱落，转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml无血清冻存液（货号：C7001），充分混匀后转入冻存管。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，若需转入液氮罐，则需在-80℃冰箱中存放至少24小时后再进行转移。

c、细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护装备），立即放入37℃水浴中解冻，直至无结晶后用75%酒精擦拭外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶，放在37℃、5% CO2培养箱中培养。
4. 次日更换至新鲜完全培养基继续培养。

四、注意事项

某些细胞可能在运输过程中贴壁不牢，导致脱落，属于正常现象。如果脱落较多，可将培养液收集至离心管中，在1000rpm离心5分钟后，收集上清进行过渡培养。然后添加胰酶进行消化，轻轻吹打后重悬，消化1-2分钟后终止反应，并再次离心，再用培养基重悬。按1:2比例进行分瓶传代并补充新的完全培养基。

五、售后条款

1）细胞出现问题的重发条件：

1. 运输途中的问题（如细胞丢失、瓶身破损、培养液漏液）可申请重发。
2. 细胞污染问题需在收到后48小时内提供真实实验结果，经核实后重发。
3. 常温运输的细胞在静置24小时后或干冰运输后的细胞复苏24小时后如未存活，提供相关照片可进行重发。
4. 如复苏后24小时内有污染现象成立的情况，亦可申请重发。
5. 细胞活性问题需在收到后的7天内提供活力检测结果后重发。
6. 在收到当天及2、3日进行拍照留存，如未告知视为产品合格。
7. 如在4-7天内出现问题，提供相关照片和记录联络技术人员判断责任，确认为我方责任者重发。

2）细胞出现问题的不可重发情况：

1. 因客户自身原因造成的细胞污染不予重发。
2. 不当操作导致细胞状态不佳不予重发。
3. 使用非推荐培养体系导致的细胞状态不佳不予重发。
4. 未提供接收前3天照片的细胞状态不良不予重发。
5. 细胞处理不当或收到后未及时告知不予重发。
6. 其他具体情况按照实际处理。

选用尊龙凯时的产品，确保细胞实验的成功率，愿您在研究中取得丰硕成果。